Le projet MEAP
Le projet MEAP pour « Multimodal multiphoton endomicroscopy of the Atherosclerosis plaque » (ANR MEAP 2024-2026, leader Dr F. Louradour, XLIM, 90k€ pour le CRMSB) vise la conception, le développement et la validation in vivo d’un dispositif d’imagerie endoscopique multimodale capable de détecter, sans l’utilisation de marqueurs exogènes, les plaques vulnérables de coronaires.
Les modalités offertes par cette fibre endoscopique permettront d’évaluer la vulnérabilité de la plaque d’athérome à travers les facteurs de risques suivants : 1) Largeur du cœur lipidique mesurée avec spectroscopie RAMAN ou CARS ; 2) Finesse de la chape fibreuse évaluée grâce à la génération harmonique de second ordre (SHG) du collagène ; 3) Présence de zones inflammatoires déterminée par le calcul du ratio redox optique (RRO), mesuré en imagerie biphotonique appelée aussi Two-Photon Excited Fluorescence (TPEF).
Ce ratio est défini comme suit : ORR = [AF FAD-like]/[AF NADH-like], où AF FAD-like et AF NADH-like représentent l’intensité de l’autofluorescence (AF) mesurée dans les spectres d’émission du FAD et du NADH, respectivement.
L’ajout du terme «-like» indique la possibilité que d’autres molécules autofluorescentes, en plus du FAD et du NADH, puissent contribuer aux signaux détectés dans ces spectres.
Puisque les zones vulnérables présentent une sur-représentation de MP pro-inflammatoires (M1) par rapport aux MP immunorégulateurs (M2), nous avons émis l’hypothèse qu’il serait possible de détecter ces régions en mesurant le ratio redox optique (RRO). Cette hypothèse repose sur le lien existant entre la polarisation fonctionnelle des MP et leur métabolisme énergétique. En effet, il est bien établi que les M1 utilisent préférentiellement la glycolyse, une voie énergétique dans laquelle du NADH est produit. En revanche, les MP M2 exploitent principalement la phosphorylation oxydative des acides gras, le cycle de Krebs et la respiration mitochondriale, générant du FAD. Concernant les MP spumeux, leur métabolisme énergétique n’était pas encore défini et leur statut de polarisation (inflammatoire versus immunorégulateur) restait sujet à controverse.
Nous avons donc entrepris d’évaluer le potentiel du RRO à discriminer, in vitro, les MP pro-athérogènes (MP inflammatoires et MP spumeux) des MP anti-athérogènes (MP immunorégulateurs). Pour réaliser cette étude, Nous avons participé à la rédaction des projets MEMIM (Multiphoton Endomicroscopy for Metabolic Imaging of Macrophages in Atherosclerosis) (Labex TRAIL 2017-2019, leader Dr G. Clofent-Sanchez, 50 k€ pour le CRMSB), et COMEMAPA (Fédération Française de Cardiologie (FFC) 2018-2020, leader Dr É. Gerbaud, 80 k€ pour nos partenaires, CRCTB et XLIM).
Afin de définir le statut phénotypique et métabolique des MP spumeux, nous avons analysé, sur les mêmes cellules, le profil phénotypique (inflammatoire versus immunorégulateur) et leurs propriétés métaboliques. Pour ce faire, nous avons combiné un immunomarquage des marqueurs de surface spécifiques (marqueurs « M1 » et « M2 »), analysé en cytométrie de flux, avec une mesure des AF FAD-like et AF-NADH-like cellulaires capturées en imagerie TPEF. Cette approche a été appliquée à différents modèles expérimentaux : des MP contrôle (non stimulés), des MP exposés à différents types et doses de LDL, ainsi que des MP activés de manière classique (modèle M1) ou alternative (modèle M2).
L’imagerie TPEF a révélé : 1) une AF NADH-like plus forte dans les M1 et MP spumeux; 2) une très forte AF FAD-like dans les MP spumeux ; 3) la possibilité de discriminer, en combinant AF NADH-like et AF FAD-like, les différents modèles de MP. Ainsi, grâce à sa sensibilité et à son caractère non destructif, l’imagerie TPEF pourrait permettre de détecter in vivo les plaques vulnérables, principalement composées de MP athérogènes (MP spumeux et MP inflammatoires).
La figure ci-dessus présente les grands types de macrophages retrouvés dans la plaque : des macrophages spumeux (mimés par le modèle Mox in vitro), des macrophages non spumeux inflammatoires (mimés par le modèle M1), deux types de macrophages athérogènes, et des macrophages immunorégulateurs anti-athérogènes (mimés par le modèle M2). Nous avons montré que l’imagerie TPEF (Two-Photon excited Fluorescence) permet de différencier in vitro ces différents modèles de macrophage.
Présentation du consortium du projet MEAP
Les partenaires de ce projet sont le Dr H. Rigneault (groupe Mosaic de l’Institut Fresnel, UMR CNRS 7249, Aix-Marseille) pour le développement de l’endoscope ; le Dr A. Kudlinski (PhLAM, CNRS 8523, Lille) pour la conception de fibres innovantes à cœur creux et à double gaine ; le Dr F. Louradour (XLIM, UMR CNRS 7252, Limoges) pour l’intégration des fibres dans une tête rotative miniaturisée. Le dispositif sera testé in vivo par Dr E. Gerbaud (CRCTB, INSERM U1045, Bordeaux) sur un modèle de lapin athéromateux développé par le CRMSB.
Voir notre papier publié sur le sujet:
Borowczyk C., Laroche-Traineau J., Brevier J., Jacobin-Valat MJ., Marais S., Gerbaud E., Clofent-Sanchez G., and Ottones F. Two-Photon Excited Fluorescence (TPEF) may be useful to delimit macrophage subsets based on their metabolic activity and cellular responses in atherosclerotic plaques. Atherosclerosis. 2020 Sep; 309:47-55. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2020.07.017.
Deux questions majeures restaient en suspens :
1) pourquoi des MP spumeux présentent-ils une forte AF FAD-like ? cela suggérait qu’ils fonctionnent selon un métabolisme énergétique normalement utilisé par les cellules immunorégulatrices or in vivo cette hypothèse est peu probable du fait du caractère inflammatoire de la zone vulnérable dans laquelle ils sont localisés ;
2) pourquoi le modèle Mox, généré avec des LDL oxydées, présente-t-il une AF FAD-like significativement plus élevée que le modèle Mac, obtenu avec des LDL acétylées?
Afin de répondre à ces questions, nous avons d’abord caractérisé ces modèles du point de vue phénotypique et fonctionnel. En intégrant, dans une analyse en composantes principales (voir images 3D rotatives (cf vidéo ci-dessous), les données de cytométrie en flux et d’imagerie TPEF, nous avons démontré que le modèle Mac se rapproche du modèle M2, tandis le modèle Mox se distingue nettement des autres modèles. L’étude des données de cytométrie a montré que Mac et Mox expriment faiblement à la fois les marqueurs M1 (CD86, CD40, CD197) et les marqueurs M2 (CD206, CD200R, CD163). Cependant, l’analyse fonctionnelle, basée sur le dosage des cytokines (inflammatoires IL-1,-6,-18 et immunorégulatrices IL-10) a révélé une production significativement plus faible d’IL-6 dans les Mac que dans les Mox, indiquant un état inflammatoire plus marqué des Mox.
Puis, nous avons déterminé la voie du métabolisme énergétique préférentiellement utilisée dans ces modèles et comparé leur stress oxydatif cellulaire. Bien que la forte AF FAD-like des Mox suggérait une orientation vers la phosphorylation oxydative (OXPHOS), l’analyse métabolique (technologie Seahorse) a révélé que les Mox avaient une respiration mitochondriale très faible, excluant le FAD comme source de cette AF, et que les deux modèles (Mox et Mac) utilisent majoritairement la glycolyse, en cohérence avec leur niveau élevé d’AF NADH-like. Toutefois, les Mac présentaient une respiration mitochondriale plus élevée que les Mox, ce qui nous a conduit à formuler l’hypothèse suivante : le modèle Mox, plus inflammatoire, pourrait accumuler davantage d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de céroïdes*.
*Les céroïdes sont des agrégats de lipides et protéines oxydés s’accumulant dans le lysosome des cellules en conditions de stress oxydant. Ces lipopigments (appelés aussi lipofuscines dans le contexte de la senescence cellulaire, présentent une AF naturelle caractérisée par un spectre d’émission très large).
Les figures et images rotatives ci-dessus présentent la discrimination des différents sous-ensembles de macrophages à l’aide de l’analyse en composantes principales (ACP) en 3-dimensions des données de cytométrie (PCP pour pourcentage de cellules positives et IFM pour Intensité de Fluorescence Moyenne des différents marqueurs M1 (CD197, CD40, CD86) et M2 (CD206, CD200R, CD163) et des données de TPEF. A gauche, l’ACP des données PCP, MFI et AF ; à droite, l’analyse des données PCP et AF. En haut, images montrant la discrimination des sous-populations de macrophage suivantes : M1, M2, MacLDL et MoxLDL ; en bas vidéo rotatives montrant : M1, M2, MacLDL, MoxLDL à gauche, additionnée des populations MacLDL+CE, MoxLDL et MoxLDL+CE, où CE correspond à l’ajout d’un extrait de carotides humaines (récupérées après endartériectomie au service du Pr E. Ducasse du servie de chirurgie du CHU de Bordeaux). Les données proviennent d’au moins 4 donneurs différents pour MoxLDL+CE et MacLDL+CE, et de 13 donneurs pour M1 et M2. L’ACP-3D a été réalisé par notre collaborateur J. Brévier du XLIM à Limoges.
Nous avons alors exploré le lien entre le stress oxydatif et la forte AF FAD-like observée dans les Mox. La réduction des ROS, du signal SenTraGor (marqueur des céroïdes) et de cette AF par l’antioxydant a-tocophérol a permis de conclure que l’AF FAD-like dans les MPs spumeux est liée au stress oxydatif et à l’accumulation de céroïdes, plus importants dans le modèle Mox que dans le modèle Mac.
Avec un AF FAD-like plus forte, le modèle Mox mime des MP spumeux à un stade avancé et le modèle Mac mime des MP spumeux à un stade précoce.
Nous pensons que ces modèles sont pertinents pour évaluer des thérapies visant à restaurer des fonctions athéroprotectrices dans des MP à divers stades de progression pathologique. Dans ce contexte, nous avons montré que la reprogrammation vers l’immunorégulation, par un cocktail de cytokines immunorégulatrices, des Mox est moins efficace que celle des Mac, mais cette différence est atténuée en ajoutant l’anti-oxidant, ouvrant de nouvelles perspectives thérapeutiques combinant immunorégulation et traitement anti-oxidant.
Par ailleurs, la distinction in vitro des modèles M1, M2, Mac et Mox grâce à l’imagerie TPEF ouvre la voie à l’utilisation de l’endoscope multimodal pour distinguer les différents types de MP dans la plaque d’athérome : les MP athérogènes (M1 et MP spumeux à un stade avancé) des MP anti-athérogènes (M2 et MP spumeux à un stade précoce).
Voir notre papier récemment publié sur le sujet avec d’autres images rotatives téléchargeables (lien en page 25 de l’article):
Henni Mansour A.S., Ragues M., Brevier J., Borowczyk C., Grevelinger J., Laroche-Traineau J., Garaude J., Marais S., Jacobin-Valat M-J., Gerbaud E., Clofent-Sanchez G., Ottones F. Phenotypic, Metabolic, and Functional Characterization of Experimental Models of Foamy Macrophages: Toward Therapeutic Research in Atherosclerosis. Int J Mol Sci. 2024 Sep 21;25(18):10146. doi: 10.3390/ijms251810146.
Afin de tester le potentiel de l’imagerie TPEF à discriminer ex vivo et in vivo les MP (inflammatoires, immunorégulateurs et spumeux) des plaques, nous avons poursuivi l’étude sur des aortes fraîchement extraites de souris Apoe-/- pour imager simultanément 1) en TPEF, le NADH et/ou le FAD produit par les MP glycolytiques et les céroïdes accumulées, et 2) les signaux de fluorescence issus d’un immunomarquage avec des anticorps dirigés contre les marqueurs de surface spécifiques de MP inflammatoires (CD40) et spumeux (LOX) (Figure A ci-dessous). Afin de pouvoir localiser ces types de MP par rapport à la zone vulnérable, nous avons analysé également des coupes fines d’aortes congelées immédiatement après extraction (Figure B ci-dessous). Les AF sont plus intenses au niveau de la zone vulnérable où sont exprimés les marqueurs Lox1 et CD40.
L’imagerie TPEF, très sensible et non destructive, pourrait permettre de détecter in vivo les plaques de coronaires vulnérables. L’ambition du projet sera ensuite de démontrer les potentialités du dispositif endoscopique multimodal pour l’imagerie métabolique in vivo des MP dans leur environnement tissulaire natif et de l’appliquer à l’imagerie diagnostique de l’athérosclérose.
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